转录组（Transcriptome）是指细胞所能转录出的所有信使 RNA（mRNA）的集合。

RNA测序技术（RNA-seq） 是转录组学中广泛使用的 NGS 应用。它涉及 mRNA 分子的测序和定量，提供生物样本中表达基因的全面快照。通过生成数百万个短测序读数，NGS 使研究人员能够准确识别和量化基因表达水平。

在进行mRNA建库的过程当中，首先要解决的问题，是如何去除核糖体RNA也就是去除“rRNA”(Ribosomal RNA)。在通常抽提到的总RNA中，绝大部分都是核糖体RNA（rRNA）。以人类的细胞或组织为例，一般抽提到的总RNA当中，95%都是核糖体RNA。剩下的2%到3%是mRNA。还有2%到3%是Long non-coding RNA、或者tRNA、microRNA,这些RNA，也就是说mRNA只占了所有RNA中的一小部分。去除核糖体RNA，并进行建库的方法，有许多种。我们主要介绍一下应用最广泛的建库方法。

下图是mRNA测序的建库过程图。

1、mRNA分离

首先是利用真核生物的mRNA都有Poly(A)尾巴这个特点，用带有Poly(T)探针的磁珠与总RNA进行杂交。然后Poly(T)探针就和带Poly(A)尾巴的mRNA结合在一起，接下来就回收磁珠，去除其他RNA。

mRNA片段化

再使用Frag/Prime Buffer对mRNA进行打断；

3、cDNA第一链合成

被打断的这些mRNA片段，通过随机六聚体引物（random hexamer primer），逆转录酶以mRNA为模版合成cDNA；

4、cDNA第二链合成

逆转录成（第一链）cDNA后，再合成出第二链（cDNA)，这样就成为双链的cDNA，纯化双链cDNA；

双链cDNA末端修复

双链cDNA的末端修复末端补齐，再纯化修复后的cDNA。双链cDNA 3’端加A（dA - tailing）。我们再在双链的cDNA的两端接上“Y”型的接头（每个接头都有一个index，不同的文库构建可以使用不同的index），纯化连接接头的ds cDNA。

6、PCR富集文库

通过PCR扩增完纯化后，进行文库质检，质检完的文库就成了标准的测序文库。

注意，不同样品的total RNA中mRNA含量差异较大，若total RNA起始投入量过低，不能保证有足够的mRNA用于后续建库，因此建议RNA起始量为1～4μg。

在建库的时候会对mRNA的完整度有较高的要求。只有在完整度高的mRNA中测序才会产生比较好的测序结果。原因就是，我们所用的Poly(T)磁珠只会去吸附靠近3'的Poly(A)序列,如果mRNA发生了降解，也就是mRNA断掉了，那么5'端的mRNA就不会被吸附上了，会在富集的过程中被洗脱掉。由此导致我们的测序结果并不准确。