摘要：试验对西伯利亚鲟的卵子进行保存技术研究。以卵子受精率为参数，探讨了稀释液、不同种类不同体积分数的保存剂、以及不同的保存液稀释比例对实验鱼类卵子进行保存的保存效果。结果显示，西伯利亚鲟的卵子保存液由以下各部分组成培养液60%~70%、营养液15%~20%、鱼卵巢液9%~23%和抗菌液1%~2%。其中，甘氨酸0.5~0.6g/L、葡萄糖1.0~2.0g/L、HEPES0.8~1.2g/L、磷酸二氢钠0.2~0.4g/L、氯化钾0.17~0.38g/L、硫酸镁0.2~0.23g/L、氯化钠5.0~7.25g/L、氯化钙0.11~0.13g/L、碳酸氢钠2.0~2.5g/L，牛血清白蛋白0.5~1.0g/L，青霉素30~35万IU/L，硫酸链霉素0.2~0.4g/L。最佳卵子保存量为1毫升/200粒。最佳卵子保存液按体积分数计其包含以下各组分：培养液65%、营养液17.5%、鱼卵巢液16%和抗菌液1.5%。研究结果为保存长江珍稀鲟属鱼类的种质资源提供了参考理论基础。
关键词：西伯利亚鲟，卵子，保存液.
鱼类主要为体外受精、体外发育的生殖方式。真骨鱼类的卵巢为封闭型卵巢，由卵巢腹膜所形成的卵巢膜包围，卵子发育近成熟时，从卵巢中脱离，落于卵巢腔中，经输卵管输出体外。成熟排出的鱼类卵子外面包有透明胶状的卵胶膜，一方面能起到防御保存的作用，另一方面卵胶膜内的胶质具有维持渗透压等作用，确保卵子处于最佳的受精状态。鱼类卵子在排出体外后，会发生形态和生物化学变化，从而导致卵子的活力下降。卵子在卵巢液中较为稳定，但在体内因发育会快速过熟，体外因产卵时卵巢液少，一般只能有效保存10-20分钟。温度、光照、溶氧、pH、渗透压及离子种类等均会影响鱼类卵子保存的效果。[1]
西伯利亚鲟(Acipenser baerii)属鲟形目、鲟科、鲟属，具有生长速度快、适应性强、肉质好、鱼籽酱品质高等优点[1]，是大型的、珍贵的淡水经济鱼类[2]，并已成为主要的鲟鱼养殖品种。在人工繁殖的过程中，由于近亲交配多种鱼类产生种质退化，遗传多样性降低，抗病抗逆性能降低等现象[3]。这将直接影响鲟鱼养殖业的可持续发展。近年来，水环境污染和过度捕捞等原因，西伯利亚鲟资源急剧下降，这必然会给西伯利亚鲟种质资源产生不利的影响。
开展长江珍稀鲟属鱼类的卵子保存技术，从降低人工繁殖成本和减少种鱼用量角度考虑[4]，对更好地保存和保存利用优良种质资源、遗传育种等方面具有重要的理论意义。拟建立一套适合类西伯利亚鲟的卵子保存技术的简易方法，以期为长江珍稀鲟属鱼类的种质保存、生产应用等提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 实验材料
实验所使用的西伯利亚鲟卵子样品由鲟鱼养殖场提供。
1.2 卵子体外保存液的配制
体外保存液配方包括以下各组分及其体积分数：培养液60%~70%、营养液15%~20%、鱼卵巢液9%~23%和抗菌液1%~2%。其中，培养液配方：甘氨酸0.5~0.6g/L、葡萄糖1.0~2.0g/L、HEPES0.8~1.2g/L、磷酸二氢钠0.2~0.4g/L、氯化钾0.17~0.38g/L、硫酸镁0.2~0.23g/L、氯化钠5.0~7.25g/L、氯化钙0.11~0.13g/L、碳酸氢钠2.0~2.5g/L。营养液包括以下各组分及其体积分数：牛血清白蛋白40%和鱼血清60%。其中牛血清白蛋白配方：牛血清白蛋白0.5~1.0g/L。抗菌液养液包括以下各组分及其体积分数：青霉素30~35万IU/L，硫酸链霉素0.2~0.4g/L。
1.3 卵子保存方法
卵子与保存液按一定比例混合，轻微吸打混匀，16~20℃下浸泡保存。
2 实验结果
2.1 最佳保存液各组分及其体积分数
依据培养液、营养液、鱼卵巢液和抗菌液的不同配比，设计了三种不同体积分数的混合实验，实验组一包含以下各组分及其体积分数：培养液60%、营养液15%、鱼卵巢液23%和抗菌液2%，实验组二包含以下各组分及其体积分数：培养液65%、营养液17.5%、鱼卵巢液16%和抗菌液1.5%，实验组三包含以下各组分及其体积分数：培养液70%、营养液20%、鱼卵巢液9%和抗菌液1%。其中，培养液配方：甘氨酸0.55g/L、葡萄糖1.5g/L、HEPES1g/L、磷酸二氢钠0.3g/L、氯化钾0.28g/L、硫酸镁0.22g/L、氯化钠6.0g/L、氯化钙0.12g/L、碳酸氢钠2.3g/L。营养液包括以下各组分及其体积分数：牛血清白蛋白40%和鱼血清60%。牛血清白蛋白浓度为牛血清白蛋白0.75g/L。抗菌液配方：青霉素33万IU/L，硫酸链霉素0.3g/L。
各实验组的西伯利亚鲟卵子的体外保存液用磷酸二氢钠调节pH至8.00，现用现配，将收集的排出体外的西伯利亚鲟成熟卵子浸泡在含有卵子体外保存液的玻璃皿中（1毫升/200粒），16~20℃下浸泡2小时后，吸去保存液进行人工授精操作，结果如表1：
表1：不同体积分数体外培养液对西伯利亚鲟卵子受精率、孵化率和畸形率的影响
受精率（%）
孵化率（%）
畸形率（%）
对照组
93.62±1.20
90.76±1.22
0.24±0.96
实验组一
89.64±1.00
88.67±1.16
0.24±0.08
实验组二
92.21±0.53
90.45±1.06
0.28±0.09
实验组三
88.63±1.07
88.43±1.16
0.35±0.09
2.2 卵子体外保存的应用
最佳体积分数西伯利亚鲟卵子体外保存液的应用，采用如下步骤：将培养液6.5ml、营养液1.75ml、鱼卵巢液1.6ml和抗菌液0.15ml混匀后，用磷酸二氢钠调节pH至8.00，现用现配，将收集的排出体外的西伯利亚鲟成熟卵子浸泡在含有卵子体外保存液的玻璃皿中（1毫升/200粒），16~20℃下浸泡2小时后，吸去保存液进行人工授精操作，结果如表2：
表2不同处理对西伯利亚鲟卵子受精率、孵化率和畸形率的影响
受精率（%）
孵化率（%）
畸形率（%）
对照组
93.51±1.13
90.85±1.17
0.23±0.13
保存组
90.82±1.21
90.49±1.29
0.32±0.13
西伯利亚鲟卵子的体外保存液在16~20℃下，保存西伯利亚鲟卵子2小时后，其仍然具有较高的受精率和孵化率。
2.3 最佳保存方法的确定
设定了3个保存时间：2小时、3小时、6小时，相同的保存温度为16~20℃，共计三个实验组和一个对照组。将最佳体积分数西伯利亚鲟卵子的体外保存液按照比例现用现配，挑选健康的雌鱼作为实验材料，将收集的排出体外的西伯利亚鲟成熟卵子浸泡在含有西伯利亚鲟卵子的体外保存液的玻璃皿中（1毫升/200粒），16~20℃下分别在浸泡2小时、3小时和6小时后，吸去保存液进行人工授精操作，结果如表3：
表3不同保存时间对西伯利亚鲟卵子受精率、孵化率和畸形率的影响
受精率（%）
孵化率（%）
畸形率（%）
对照组
94.46±1.26
90.92±2.97
0.24±0.27
2h
91.18±1.67
90.28±2.67
0.27±0.10
3h
90.39±1.26
89.52±1.85
0.26±0.11
6h
82.44±1.12
84.76±0.27
0.49±0.10
从表3中可以看出，西伯利亚鲟卵子的体外保存液在16~20℃下，保存西伯利亚鲟卵子长达6小时后，其仍然具有较高的受精率和孵化率，但相比于2小时和3小时的保存时间，6小时的保存时间受精率和孵化率有所下降，建议西伯利亚鲟卵子的保存时间为2~3小时。
2.4 最佳保存量的确定
将最佳体积分数西伯利亚鲟卵子的体外保存液按照比例现用现配，挑选健康的雌鱼作为实验材料，将收集的排出体外的西伯利亚鲟成熟卵子按照1毫升/100粒、1毫升/200粒、1毫升/500粒浸泡在含有西伯利亚鲟卵子的体外保存液的玻璃皿中，16~20℃下浸泡2小时后，吸去保存液进行人工授精操作，结果如表4：
表4不同保存量对西伯利亚鲟卵子受精率、孵化率和畸形率的影响
受精率（%）
孵化率（%）
畸形率（%）
对照组
94.83±1.07
92.61±1.12
0.16±0.11
1毫升/100粒
92.66±1.05
90.54±0.92
0.26±0.09
1毫升/200粒
91.54±1.24
90.36±0.97
0.26±0.09
1毫升/500粒
80.56±0.96
83.38±1.27
0.46±0.11
从表4中可以看出，西伯利亚鲟卵子的体外保存液在16~20℃下，按照1毫升/200粒，保存西伯利亚鲟卵子2小时后，西伯利亚鲟卵子受精率和孵化率较高，随着保存量的增加，西伯利亚鲟卵子受精率和孵化率有所下降，建议保存量为1毫升/200粒。
3 讨论
不同动物卵子适用的卵子保存液不同，常见的保存液一般分为化学保存液、生物保存液、化学-生物保存液。化学保存液由有机物和无机物混合而成，由于化合物的刺激性和复杂性，其保存效果相比于源环境而言，保存效果较差。生物保存液原材料源于生物体内或生物分泌物，其保存效果较好，但是造假不菲，且不符合实际需求。实验中使用的卵子保存液为了实现更好的保存效果，采用了部分鱼卵巢液，目的是为了降低使用成本和追求更好的保存效果。通过不同比例的保存液各组分及其体积分数的实验结果显示，卵子体外保存液的最佳条件是体外保存液按体积分数计其包含以下各组分：培养液65%、营养液17.5%、鱼卵巢液16%和抗菌液1.5%。
抗菌环境是保存液中较难实现的，实验中使用的抗菌液成分为青霉素33万IU/L，硫酸链霉素0.3g/L。在水产技术领域，抗菌物质除了使用青霉素和链霉素外，还存在有左氧氟沙星、多西环素、土霉素、环丙沙星、洛美沙星等，但是在实验过程中发现这些物质都会影响到卵子的受精率、孵化率和畸形率，比如我们在使用左氧氟沙星作为抗菌剂的过程中发现西伯利亚鲟卵子的孵化率和畸形率显著性增加，是因为左氧氟沙星可以抑制RNA的转录和复制，从而导致受精卵在发育不全，类似的问题在使用多西环素、土霉素、环丙沙星、洛美沙星中均有发生。
卵子采集之后，保存液的使用浓度直接决定了保存液的保存效果。最适的使用浓度是影响卵子受精率的重要因素，在鱼类和哺乳动物精液稀释过程中，稀释倍数太大会导致精子活力下降[5]。由于鱼类主要为体外受精、体外发育的生殖方式，被保存液稀释后的卵子液会直接影响受精结果。结果表明，西伯利亚鲟卵子体外保存液在16~20℃下，按照1毫升/200粒，保存西伯利亚鲟卵子2小时后，西伯利亚鲟卵子受精率和孵化率较高，随着保存量的增加，西伯利亚鲟卵子受精率和孵化率有所下降，建议保存量为1毫升/200粒。
参考文献
1. 罗刚,高勇,陈学洲,等.北方池塘西伯利亚鲟养殖试验[J].中国水产, 2008(10):43-44.
2. 杨移斌,夏永涛,曹海鹏,等.西伯利亚鲟基本生物学特性及养殖介绍[J].水产养殖,2013(11):17-19.
3. 刘鹏,庄平,章龙珍,等.人工养殖西伯利亚鲟精子超低温冷冻保存研究[J].海洋科学,2007,29(2):120-127.
4. 赵强、赵清良,殷宁.暗纹东方鲀精液冷藏对精子活力、受精率和孵化率的影响[J].南京农业大学学报,1999,22(4):57-60.
5. Paniagua- Chavez CG, Buchanan JT, Tiersch TR. 1998. Effect of extendersolutions and dilution on motility and fertilizing ability of Easternoyster sperm[J]. J Shellfish Res,17(1-3):231-237.
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